标记免疫分析技术

一、概要

 定义：应用广泛、先进的免疫分析技术，是生物活性物质分析方法的新领域；基本技术是将多种标记示踪技术和高度灵敏性和医学免疫学抗原抗体反应的高度特异性相结合的分析技术。

 特点：灵敏度高，特异性强，重复性好，准确性高，操作简便，易于自动化商品化。

 发展：放射免疫分析，免疫放射分析，酶标记免疫分析，化学发光免疫分析，电化学发光免疫分析，荧光免疫分析，金属离子免疫分析。

 应用：医学诊断，治疗监测，还可应用于药物监测，食品，兽医学，环境监测。

二、放射免疫分析，免疫放射分析

  1959年，Yalow,Berson创始发放射免疫分析（RIA），1968年，Miles,hales建立免疫放射分析（IRMA）。20世纪80年代中后期在许多科研院所和各级医院的应用范围达到相当普及的程度。

 放射免疫分析原理：放射性标记（I¹²⁵）抗原和非标记抗原（待测物）同时与限量的特异抗体进行竟争结合反应，通过分离未结合的标记抗原，测定标记抗原与抗体的复合物放射强度信号，经相应的数学函数关系推算待测抗原的含量。此法也叫竟争性放射免疫分析。             反应式：Ag* + Ag + Ab（限量）→Ag*-Ab + Ag-Ab + Ag* 。反应式中，Ab为限量，Ag*与Ag理化性质相同，Ab      要求与抗原有较高亲和力，较高的滴度和高特异性。          

  免疫放射分析（IRMA）原理：过量的标记（I¹²⁵）抗体直接与待测抗原结合，经与游离标记抗体分离，去除游离标记杭体，测定复合物的放射性计数，计算待测物含量。反应式：Ag + Ab*过量）→ Ag-Ab*+Ab* 。 

IRMA方法分两种，一种为单位点IRMA法，另一种为双位点IRMA法。单位点IRMA中抗原分子只需一个反应位点决定簇，与标记抗体上一个相应结合点反应，形成复合物后分离游离的标记抗体；双位点IRMA也称双抗夹心法，采用固相抗体与标记抗体同时与待测抗原的两个反应位点决定簇结合，形成待测抗原夹在两抗体分子中间，通过洗涤，分离游离的标记抗体，帮非待异结合（NSB）较低，大提高了测定灵敏度。

在双位点IRMA反应体系中，过量固相包被抗体与待测抗原结合后，再与过量I¹²⁵ 标记抗体进行结合反应，形成“固相抗体-待测抗原-酶标记抗体”夹心复合物，经洗涤去除多余游离的标记抗体，复合物上的标记I¹²⁵作为信号产物直接进行放射计数测量，通过相应函数曲线计算待测物抗原含量。

特点：灵敏度高，特异性好，但放射性标记物存在人体危害、环境污染且半衰期短，限制了使用和发展。

三、酶标免疫分析

 1971年，Engvall,Vanweemen以酶代替同位素，创立了酶免疫分析技术（EIA）。EIA是将酶催化化学反应的放大作用和抗原抗体免疫反应的待异性结合起来的一种微量分析技术。

 酶标记抗原或抗体后，既不会影响抗原和抗体的免疫反应特性，也不会改变酶本身的催化活性。在EIA系统中，免疫反应进行后，标记在抗原或抗体上的酶可以催化相应底物产生呈色反应（或荧光反应，化学发光反应等），转化为可检测的信号，通过信号的测定可以检测出待测物的含量。

分类：EIA可分为均相的酶免疫分析和非均相的酶免疫分析。

 均相EIA ：主要通过酶标记抗原（Ag^-E）同抗体（Ab）结合形成酶标记免疫复合物（Ag^-E-Ab）改变了标记酶的活性，增强或减弱，因此不需要将反应系统中Ag^-E-Ab与游离的酶标记抗原Ag^-E进行分离，通过催化底物呈色反应，测定酶活性变化，即可推算出待测抗原（Ag）的含量。如酶增强免疫分析（EMIT）是最常用的均相EIA系统，属竞争性免疫分析法。 其反应式：Ag^-E+ Ag(待测) + Ab(限量)→Ag^-E-Ab+AgAb+ Ag^-E 。其中Ag^-E与底物（Sb）反应产生可测信号。在反应体系中，待测抗原含量（Ag）越多，竟争结合抗体越多，使酶活性受抑制的免疫复合物（Ag^-E-Ab）越少，游离Ag^-E（具有酶活性）越多，催化底物产生信号产物越多。因此称之为“酶增强的免疫分析技术”

 特点：便于自动化（由于不要求分离结合和游离的标记抗原），主要应用于小分子半抗原药物和小分子激素的测定，干扰较大（由于不要求分离结合和游离的标记抗原）。

 非均相EIA：是目前使用最多的一类免疫学检测方法。原理是在抗原抗体反应达到平衡后，需采用适当方式将游离的酶标记物与抗原抗体结合的酶标记物加以分离，在通过底物显色进行测定。可分为非均相液相酶免疫分析和非均相固相酶免疫分析。

 非均相液相酶免疫分析：主要用于测定小分子半抗原物质。其原理为：待测物或标准品（Ag）、特异性抗体（Ab）、酶标记抗原(Ag^-E)相继加入，混匀，待反应平衡后，再加入分离剂，将结合与游离成分加以分离，然后加底物显色测定。

  非均相固相酶免疫分析：原理是将已知抗体或抗原吸附在某种固体支持物（载体）上，加入待测样品（待测抗原或抗体），使抗原抗体反应结合在固相载体上，洗涤分离去除游离的成分，再加入酶标记物及底物，显色，测定。

 目前最常用的固相EIA方法是以聚苯乙烯制品作为载体的酶联免疫吸附度验（ELISA）。ELISA的应用十分广泛，可用于检测各种抗原和半抗原，也可用于检测抗体。根据检测目的和操作步骤不同可分为：间接法、双抗体夹心法、竟争法。

  间接ELISA法：抗体检测常用方法，其原理主要是利用酶标记的抗抗体（第二抗体）检测已与固相抗原结合的待测抗体，故称为间接法。操作步骤（反应步骤）：将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原，洗涤去除未结合抗原；加入适当稀释待检血清，使待检抗体与固相抗原结合，洗涤去除未反应物质；加入酶标记抗抗体，使之与固相免疫复合物中的抗体结合，洗涤去除未结合的酶标记抗体；加入底物显色，显色深浅表示待测抗体含量。

  双抗体夹心ELISA法：检测抗原常用的方法，但仅适用于两价或两价以上的抗原。操作步骤（反应步骤）：将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体，洗涤去除未结合抗体；加入待检抗原样品，使待检抗原与固相抗体结合，洗涤去除未反应物质；加入酶标记的另一个特异性抗体，使之与固相免疫复合物中的抗原结合，洗涤去除未结合的酶标记抗体；加入底物显色，显色深浅表示待测抗原含量。

 竟争ELISA法：可用于检测抗原和小分子半抗原，也可用于检测抗体。操作步骤（反应步骤）：（以测定抗原为例）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体，洗涤去除未结合抗体；加入样品（待检抗原）和酶标记抗原使二者与固相抗体竟争结合，洗涤去除未结合的成分；加入底物显色，显色程度因待检抗原、酶标记抗原与固相抗体竟争结合的结果相关。

四、化学发光免疫分析

 1981年Pannagli建立化学发光免疫分析（CLIA），经过不断的改进和发展，已成这免疫分析中灵敏、特异、快速、可自动化，最实用最有前途的方法。

 基本原理：与RIA、IRMA一样，CLIA也包括有免疫结合反应和产生信号的标记物两部分组成，只是所用的标记物或检测信号不同；化学发光分析系统是利用在化学反应中释放大量自由能产生激发态中间体，当其回到稳定的基态时，同时也发射出光子，利用发光信号测量仪对所发出的光量子进行定量测定。

 CLIA的主要原理是是基于将发光物质或触发产生发光的物质直接标记在抗原（化学发光免疫分析）或抗体（免疫化学发光分析）上，或经过酶促放大发光底物的发光反应，这其中两个过程即免疫反应和化学发光反应。发光反应的基本过程为激发发光物→电子激发态中间体→基态+光量子。

 反应原理包括：

非竟争结合反应：固相-Ab+Ag（待测物）+Ab^-L→固相-Ab-Ag-Ab^-L→激发发光→光量子

竟争结合反应：Ag+ Ag^-L + Ab （定量）→Ag-Ab+Ab-Ag^-L→激发发光→光子

 按标记方法可分为：直接标记法和酶标记作用化学发光底物即化学发光酶免疫分析法。

五、电化学发光免疫分析（ECLIA）

 是80年代末发展起来的一种新的化学发光免疫分析方法，其发光信号不是通过启发化学发光剂或激发化发光底物使其从激发态回到基态的基本过程产生信号，其基本原理主要是根据三联吡啶钌[Ru(bpy₃)] ²⁺和三丙胺在电场（非化学反应）触发下产生发光的化学发光反应。

  ECLIA分析原理：是在电极表面引发的特异性化学发光光反应，参与反应的发光试剂标记物是三联吡啶钌[Ru(bpy₃)] ²⁺，另一种试剂是三丙胺（TPA）。在阳极表面，以上两种电化学活性物质可同时失去电子发生氧化反应，2价的[Ru(bpy₃)] ²⁺标记物被氧化成3价的[Ru(bpy₃)] ³⁺标记物，TPA被氧化成阳离子自由基TPA^+*，这TPA^+*很不稳定，可自发地释放一个质子而变成自由基TPA*，其为还原剂，可将一个电子给3价的[Ru(bpy₃)] ³⁺，使其形成激发态的[Ru(bpy₃)] ^2+*，而TPA自身被氧化成氧化产物。激发态的[Ru(bpy₃)] ^2+*， 衰减的同时发射一个波长为620nm的光子，重新形成基态的[Ru(bpy₃)] ²⁺。以上发光反应在电极表面周而复始地不断循环进行，产生许多光子，使信号增强。

六、荧光免疫分析（FIA）：

 早在40年代已用荧光素标记抗原或抗体，经不断的研究改进，直到时间分辨荧光免疫分析和荧光偏振测定技术的问世才开创了荧光免疫分析定量的新时期。现使用较多的是时间分辨荧光分析（TRFIA）。也叫“解离-增强镧系荧光免疫分析（DELFIA）”。最大特点利用镧系元素铕（Eu）光谱性质的固有特点，（1）Eu³⁺激发光波长为337nm,而其发射波长为615nm，其Stokes位移达278nm,很容易对激发光和发射光进行波长分辨，排除了激发光的干拢；（2）Eu³⁺的荧光衰变时间为714μs，较普通荧光团和分析样品中一些蛋白质的荧光衰变时间长，因此利用时间分辨荧光免疫分析仪特定程序，延迟一定时间测量，便可获得Eu³⁺的特定性荧光信号。

  基本原理：具有双功能基团的螯合物一侧连接Eu，一侧连接抗原或抗体，形成标记免疫物；在Eu³⁺的增强液中与另一种螯合物结合，在协同剂的作用下，形成一个Eu³⁺在其内部的保护性微胶囊（胶态分子团），它在紫外光等的激发下能发射出很强的荧光信号，与待测抗原或抗体相关。

 主要分析方法和技术特点：（1）双位夹心分析法（2）竟争分析法

七、金属离子免疫分析法：