流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。 

流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。

[细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量]

1、外周血淋巴细胞样品的制备：分离单个核细胞

1．取人外周血5mL，肝素抗凝，用等量hanks缓冲液或者RPMI 1640稀释成10mL,混匀；

2. 淋巴细胞分离液10mL加入离心管中，轻轻将稀释后的外周血加入到淋巴细胞分离液液面上，保持清晰分层状态。

3.室温下400g离心30min。

4.离心完后可以见到离心管内的血液分为清晰的四层，上层为血浆层，可以取来做ELISA。中间层为分离液层。在上中层界面处有一个以单个核细胞为主的灰白色云雾带，即为淋巴细胞和单核细胞，还包括血小板。底层为红细胞。
5.吸出中间层单个核细胞，如有红细胞污染稍微破红即可。

2、培养细胞的样品制备：

蛋白酶消化→机械吹打→使贴壁细胞脱落→洗涤      尼龙网过滤

3、新鲜实体组织单细胞悬液的制备

机械法

a. 用剪刀剪碎或者用锋利的解剖刀剁碎组织；

b. 将剪碎的组织加入匀浆器中匀浆；

c. 用吸管或注射器抽吸细胞悬液，以分散细胞；

将细胞悬液在尼龙网或不锈钢网上过滤，滤出的细胞悬液细胞计数后即可使用。

酶处理法

这里中洪博元小编仅介绍组织消化的一般过程，对于每种组织消化时所用的具体步骤需参考该组织细胞培养时的消化方法。

a. 将组织剪成l～2mm3左右的小块。

b. 用胰蛋白酶或胶原酶消化组织块，胰蛋白酶适用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等组织。胰蛋白酶工作浓度一般为0.1％～0.5％。对于纤维较多的组织或较硬的癌组织常用0.25％胶原酶，胶原酶对组织中胶原蛋白类结构消化作用强，它仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。胶原酶常用剂量为0.1～0.3ug／m1。用大于组织量30～50倍的胰蛋白酶液或胶原酶液在37℃条件下消化组织，需每隔一定时间摇动一次。消化时间的长短依组织类型而定，一般来说，胰蛋白酶需作用20～60分钟，胶原酶需4～48小时。在消化过程中，如发现组织块已分散而失去块的形状，经摇动即可成为絮状悬液，则可取出少量液体在显微镜下观察，可见分散的单个细胞和少量的细胞团，可认为组织已消化充分。

c. 消化完毕后，将细胞悬液通过100目孔径尼龙网或不锈钢网滤过，以除掉未充分消化的组织。

d. 已过滤的细胞悬液经800～1000rpm低速离心5～10分钟后，弃上清液，加PBS液，轻轻吹打形成细胞悬液，细胞计数后即可使用。

化学试剂处理法

表面活性剂处理法

4、单细胞悬液的保存

深低温保存法（一年）

乙醇或甲醇保存法（2周）

甲醛或多聚甲醛保存法（2月）

1、几种常见的荧光染料

2、免疫荧光标记方法

直标：干扰少,但需购买多种单抗

间标：步骤多,干扰多,不需标记多种抗体

组合标记